Wstęp

Celiakia, czyli nietolerancja glutenu, jest immunologiczną chorobą przewodu pokarmowego spowodowaną spożyciem glutenu. Za szkodliwe działanie odpowiedzialne są głównie białka prolaminowe glutenu, zawierające dużo aminokwasu proliny i glutaminy. Ze względu na wysoką zawartość proliny (ok. 15%) i glutaminy (ok. 35%) oraz ze względu na strukturę spirali białek prolaminowych ich trawienie jest utrudnione (Sollid, Khosla, 2005). Białko prolaminowe żyta (sekalinę), jęczmienia (hordeinę), pszenicy (gliadynę) i aweninę, która występuje w mniejszych ilościach w białku owsa, przyjęto ogólnie nazywać glutenem. Białka kukurydzy, gryki, ryżu, prosa i, sorgo uznawane są za bezpieczne dla osób chorych na celiakię.

Celiakia występuje u ok. 1% populacji i jest chorobą związaną z wytwarzaniem przeciwciał skierowanych przeciwko prolaminom glutenu. Choroba powoduje uszkodzenie kosmków jelitowych, co wywołuje szereg zaburzeń metabolicznych, m.in. obniżenie wchłaniania składników odżywczych ze spożywanej żywności. Ze względu na to, że jedyną skuteczną metodą leczenia celiakii jest unikanie spożywania produktów zawierających gluten, istotne jest opracowanie wiarygodnej metody oznaczania glutenu m.in. w celu zapewnienia, że produkty spożywcze, deklarowane jako bezglutenowe, są faktycznie bezpieczne dla osób chorych na celiakię.

Celiakię wywołują peptydy powstające z prolamin, które nie są w pełni trawione przez proteazy człowieka. Trwają intensywne badania nad zależnością struktury peptydów powstających po trawieniu glutenu a ich toksycznością. Badania toksyczności poszczególnych peptydów przeprowadzane in vitro oraz in vivona szczurach i u ludzi wykazały, że peptyd 33-mer, który nie jest trawiony w przewodzie pokarmowym na żadnym etapie (Shan i wsp., 2002), może być uznany za najbardziej toksyczny. Metody badań wykrywania i oznaczania glutenu w produktach spożywczych skupiają się aktualnie na określaniu ich immunotoksyczności wywołanej poszczególnymi toksycznymi peptydami, a odchodzi się od oznaczania ogólnej zawartości glutenu w produktach spożywczych.

Obecnie w badaniach toksyczności glutenu stosuje się głównie metody immunologiczne. Opierają się one na reakcji przeciwciał z poszczególnymi toksycznymi peptydami. Przeciwciała stosowane w metodach oznaczania glutenu wytwarzane są u zwierząt doświadczalnych, takich jak myszy i króliki przez ich immunizację w wyniku podawania im peptydowych fragmentów prolamin. Fragmenty peptydowe uzyskiwane są przez proteolizę prolamin lub wytwarzane syntetycznie. Po wywołaniu odpowiedzi immunologicznej otrzymuje się poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała, które służą do oznaczania glutenu w produktach spożywczych.

Tendencje do badania poszczególnych immunotoksycznych peptydów, a nie ogólnej ilości prolamin, spowodowały opracowanie nowej generacji przeciwciał. Najnowszym osiągnięciem są opatentowane przeciwciała G12 i A1 (Patent No.: WO2013098441 A1), które reagują z peptydem 33-mer. Przeciwciała te wykorzystywane są w czułej i specyficznej metodzie tzw. metodzie G12.

Metoda R5 wykrywania glutenu w produktach spożywczych

AOAC International zaakceptowało metodę R5 “Gliadin as a Measure of Gluten in Foods” jako Metodę Oficjalną nr 991.19. W metodzie R5 zastosowano przeciwciała reagujące głównie w odniesieniu do peptydu QQPFP obecnego w gliadynie pszenicy, sekalinie żyta, hordeinie jęczmienia. Przeciwciała stosowane w metodzie R5 są również w stanie rozpoznawać podobne peptydy, takie jak LQPFP, QLPYP, QLPTF, QQSFP, QQTFP, PQPFP i QQPYP, aczkolwiek ze znacznie niższą czułością (Osman i wsp., 2001). Metoda R5 pozwala na zidentyfikowanie i oznaczenie ilościowe toksycznego białka pszenicy, jęczmienia i żyta, co sprawia, że może być stosowana do oceny obecności zanieczyszczeń glutenem w żywności bezglutenowej. Metoda ta dawała zawyżone wyniki dla jęczmienia, a dla zhydrolizowanego glutenu uzyskiwano wyniki nieprawidłowe (Thompson i Méndez, 2008). Opracowano szereg modyfikacji metody, co pozwoliło m.in. oznaczać zhydrolizowany gluten. Granica wykrywalności metody wynosi od 0.30 do 1.22 ng/ml.

Badania biegłości przeprowadzone w 2012 r. (Immer, 2012) potwierdziły, że metoda R5 pozwala na oznaczanie niskich zawartości glutenu z dobrą odtwarzalnością i powtarzalnością. Metoda daje prawidłowe wyniki dla próbek, które nie zawierają owsa, co stanowi duże jej ograniczenie. Hernando A. (2008) wykazał, że metoda R5 nie wykrywała owsa w niektórych próbkach z 25 badanych próbek różnych odmian owsa.

Problem toksyczności owsa dla osób chorych na celiakię jest istotny ze względu na fakt, że niektórzy autorzy wskazują, iż awenina owsa u niektórych pacjentów może indukować aktywność T-cells, powodując stan zapalny i atrofię w jelitach (Pulido i wsp., 2009). Arentz-Hansen i wsp. (2004) opisali uszkodzenia kosmków jelitowych u osób chorych na celiakię w wyniku spożywania owsa podczas stosowania diety bezglutenowej. Awenina owsa może mieć podobne oddziaływanie jak gluten pszenicy, żyta lub jęczmienia. Badania 19 dorosłych pacjentów chorych na celiakię, którzy spożywali 50 g owsa/dzień przez okres 12 tygodni, wykazały, że może wystąpić u nich wrażliwość na owies. Istotne jest zatem wykrywanie i oznaczanie ilościowe potencjalnie toksycznego owsa w diecie osób chorych na celiakię (Arentz-Hansen i wsp., 2004; Pulido i wsp., 2009). Nowa metoda G12 pozwoliła na pogłębienie badań w zakresie toksyczności białka owsa.

Metoda G12

Metoda odpowiednia do oznaczania glutenu powinna być nie tylko wiarygodnym wskaźnikiem obecności prolamin w odmianach zbóż znanych z toksyczności dla osób chorych na celiakię, tak jak jest w metodzie R5, lecz także powinna rozpoznawać specyficzne fragmenty odpowiedzialne za tę toksyczność. Problemem jest, że w białku prolamin jest wiele takich obszarów o większej lub mniejszej toksyczności i wiele z nich dotychczas nie zostało zidentyfikowanych (Mena, 2015). Najnowszym osiągnięciem w zakresie metod wykrywania i oznaczania glutenu w produktach spożywczych jest otrzymanie przeciwciał A1 i G12, które wykrywają najbardziej immunotoksyczny fragment gliadyny, tj. 33-mer. Reaktywność tych przeciwciał została skorelowana z potencjalną immunotoksycznością zbóż, z których ekstrahowano białka (Moron, Bethune i wsp., 2008, Ehren, 2009).

Metoda immunoenzymatyczna ELISA G12 została po raz pierwszy opisana przez Moron, Bethune i wsp. w roku 2008. Metoda wykazuje wysoką korelację pomiędzy obecnością peptydu i ilością zboża toksycznego dla chorych na celiakię. W kolejnych badaniach potwierdzono wysoką przydatność metody (Moron, Cebolla i wsp. 2008, Mena 2009).

Metodę poddano walidacji, w wyniku której stwierdzono, że jej czułość jest znacznie wyższa niż innych równoważnych metod rozpoznających szkodliwe peptydy w glutenie. Granica wykrywalności dla pszenicy, jęczmienia i żyta wyniosła poniżej 1 ppm prolaminy. W celu wykrycia małotoksycznego owsa wymagana była większa ilość próbki. Metoda prawidłowo wskazywała na bezpieczeństwo kukurydzy i ryżu. Szczególną przydatność metody stwierdzono w badaniach dyskutowanej toksyczności owsa. Comino w roku 2011 badała różne odmiany owsa, które wykazywały różny stopień toksyczności dla osób chorych na celiakię. Wykazano wysoką korelację pomiędzy wynikami oznaczeń prolamin w owsie, uzyskanych metodą G12, a wynikami badań klinicznych.

Wiele czynników wpływa na dokładność oznaczeń glutenu w żywności. Należą do nich m.in. modyfikacja białek w wyniku procesów technologicznych, interferencja innych składników żywności, zastosowanie właściwych wzorców. Modyfikacja białek w wyniku procesów technologicznych obejmuje głównie enzymatyczną deamidację lub transamidację oraz degradację w wyniku różnego rodzaju hydroliz. Zaletą metody G12 jest to, że pozwala ona prawidłowo określać zawartość toksycznego glutenu w żywności poddanej ogrzewaniu lub enzymatycznym procesom, które mogą powodować częściową deamidację glutenu. Gell (2015) porównała metodę R5 i G12. Wykazała, że metoda R5 wykazuje na ogół wyższe wartości w porównaniu z metodą G12. W porównaniu przeprowadzonym przez Hocheggera (2015) obie metody wykazywały podobne wyniki.

Producenci testów

Głównym producentem testów R5 jest firma R-Biopharm AG, Niemcy. AOAC wydało certyfikat dla zestawu „R-Biopharm’s RidaScreen® Gliadin method”. Przeciwciała G12, stosowane w metodzie G12, zostały opatentowane i są stosowane w takich komercyjnych testach, jak np. AgraStrip Gluten12, nr kat. COKAL0200AS, AgraQuant® Gluten G12 nr katalogowy: COKAL0200 produkowanych przez firmę Romer Labs Diagnostic GmbH, Austria oraz w testach GlutenTox kits firmyBiomedal, Hiszpania.

Aspekty prawne

Kodeks Żywnościowy (2007, 2008) określił ogólne wytyczne dla metod, które mogą służyć do wykrywania lub ilościowego oznaczania glutenu w produktach spożywczych. Wytyczne wskazywały, że powinna to być metoda immunologiczna, lub inna zapewniająca równie wysoką czułość i specyficzność jak metody immunologiczne. Stosowane w metodzie immunologicznej przeciwciała powinny reagować z toksycznymi fragmentami białek zbóż, a nie powinny reagować z innymi białkami zbóż lub z innymi składnikami zbóż. Metoda stosowana do oznaczeń glutenu powinna zostać zwalidowana i wywzorcowana przy użyciu materiału referencyjnego, o ile taki materiał jest dostępny. Granica oznaczalności metody powinna wynosić 10 mg glutenu na kg lub poniżej. Jakościowe wykrywanie glutenu powinno opierać się na odpowiednich metodach, takich jak metoda immunoenzymatyczna ELISA lub metody opierające się na wykrywaniu DNA. Powyższy dokument wskazał, że metodą spełniającą wymagania dla ilościowego oznaczania glutenu w produktach spożywczych jest np. immunoenzymatyczna metoda ELISA R5 Metoda Mendeza.

W roku 2014 podczas 36. Sesji Kodeksu Żywnościowego (Codex, 2014) Austria przedstawiła oficjalny komentarz, aby metoda G12 została włączona do wykazu metod Kodeksu Żywnościowego (Codex Standard 118-1979, 2008) jako metoda odpowiednia do oznaczeń glutenu. W uzasadnieniu przedstawiono spełnienie przez metodę wszystkich wymagań określonych przez Kodeks Żywnościowy.

Ponadto przedstawiono uzasadnienie, że metoda ELISA, wykorzystująca przeciwciała G12 (AgraQuant® Gluten G12), została zaaprobowana przez AACC (AACC 2014) jako metoda międzynarodowa nr 38-52.01. Podstawą do uznania metody G12 przez AACC były m.in. badania biegłości (Abbott, 2010, Don, 2014 i Don, 2014). Badania biegłości przeprowadzono przy zastosowaniu do badań 12 próbek ryżu, czekolady, chleba kruchego. Próbki były fortyfikowane glutenem na 5 poziomach. Metoda została również przyjęta przez AOAC (AOAC, 2014) jako oficjalna metoda badań o nr. 2014.03.

Jako uzasadnienie dla wpisania metody G12 do Kodeksu Żywnościowego Austria przedstawiła również własne wyniki badań porównawczych metody R5 i G12. Badano 50 różnych próbek produktów spożywczych znakowanych jako produkty bezglutenowe obiema metodami. Uzyskano podobne wyniki badań. W roku 2015 w badaniach 43 różnych próbek potwierdzono, że obie metody dają porównywalne wyniki (Hochegger, 2015). W świetle przedstawionych danych metoda G12 może być uznana za metodę co najmniej równoważną z metodą R5.

Piśmiennictwo

1. Mena MC, Hernando A, Lombardía M, Albar J., The application of proteomics in gluten analysis: Identification and characterization of prolamins and glutelins through mass spectrometry. Proceeding of the 23rd Meeting Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity. 2009, 23-28.
2. Hochegger R., Mayer W., Prochaska M., Comparison of R5 and G12 Antibody-Based ELISA Used for the Determination of the Gluten Content in Official Food Samples Foods, 2015, 4, 654-664.
3. Hernando A., Mujico JR, Mena MC, Lombardía M, Méndez E, Measurement of wheat gluten and barley hordeins in contaminated oats from Europe, the United States and Canada by Sandwich R5 ELISA. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2008, 20, 6, 545–554.
4. Gell G., Kovács K., Molnár I. et al., Celiac disease-specific prolamin peptide content of wheat relatives and wild species determined by ELISA assays and bioinformatics analyses, Cereal Research, 2015, akademiai.com, www.editorialmanager.com/crc/ download.aspx?id=9175&guid.
5. Ehren J, Moron B, Martin E, Bethune MT, Gray GM, Khosla C., A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. PloS One, 2009, 4, 7, e6313.
6. Don C, Halbmayr-Jech E, Rogers A, Koehler P., AACCI approved methods technical committee report: Collaborative Study on the Immunochemical Quantitation of Intact Gluten in Rice Flour and Rice-Based products by G12 Sandwich ELISA Cereal Foods World 59, 2014, 187-193.
7. Don C., Halbmayr-Jech E., Rogers A., Koehler P., 4.1 Collaborative Study on the immunochemical determination of intact gluten in rice flour and rice based products by G12 sandwich ELISA – progress report w: Proceedings of the 27th MeetingWorking Group on Prolamin Analysisand Toxicity (PWG), 2014.
8. Comino I., Real A., de Lorenzo L., Cornell, H., López-Casado M.A., Barro F., Lorite P., Torres M.I., Cebolla A., Sousa C., Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease, Gut, 2011, 60 (First Online), 915–22.
9. Codex Alimentarius Commission. INT FAO/WHO Food Standards Programme Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses Thirty-sixth Session, Kuta, Bali, Indonesia, 24–28 November 2014. Proposals for New Work Comment from Austria: Proposal for an extension of the method recommendation in CODEX STAN 118–1979 (Codex Standard for Foods for Special Dietary Use or Persons Intolerant to Gluten) with a method that accurately detects the toxic fraction in gluten harmful for individuals intolerant to gluten: the ELISA G12 method.
10. Codex Alimentarius Commission. Codex       Standard 118-1979 rev. 2008, Foods       for special dietary use for persons intolerant to gluten Codex Alimentarius FAO/WHO Rome, 2008.
11. Codex Alimentarius Commission: Draft Revised Standard for Foods for Special Dietary Use for Persons intolerant to Gluten (at Step 8). Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses. Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius CommissioN. Thirty-first Session Geneva, Switzerland, 30 June – 4 July 2008, Report of the 29^th session of the Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses 2007, ALINORM 08/31/26, 50-51.
12. Arentz-Hansen H., Fleckenstein B., Molberg Ø., Scott H., Koning F., Jung G., Roepstorff P., Lundin K.E., Sollid L.M., The molecular basis for oat intolerance in patients with celiac disease. PLoS Medicine, 2004, t. 1, 84–92.
13. AOAC Official Method 2014.03: Gluten in Rice Flour and Rice-Based Food Products G12 sandwich ELISA, First Action 2014.
14. Abbott M, Hayward S, Ross W, Godefroy SB, Ulberth F, van Hengel AJ, Roberts J, Akiyama H, Popping B, Yeung JM, Wehling P, Taylor SL, Poms RE, Delahaut P: Validation procedures for quantitative food allergen ELISA methods: community guidance and best practices. J. AOAC Int., 2010, 93, 442-450.
15. Moron, B., Cebolla, A., Manyani, H. et al., Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide, Am. J. Clin. Nutr., 2008, 87, 405–414.
16. Mena MC, Sousa C., Analytical Tools for Gluten Detection. Policies and Regulation. In: Arranz E, Fernández-Bañares F, Rosell CM, Rodrigo L, Peña AS (editors), Advances in the Understanding of Gluten Related Pathology and the Evolution of Gluten-Free Foods. Barcelona, Spain, OmniaScience, 2015, 527-564.
17. Moron B, Bethune MT, Comino I. et al., Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PloS One, 2008, 3, 5, e2294.
18. Osman, A.A., Uhlig, H.H., Valdes, I., Amin, M., Mendez, E., Mothes T., A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur. J. Gastroent. Hepatol, 2001, 13, 1189-1193.
19. Pulido O., Gillespie Z., Zarkadas M., Dubois S., Vavasour E., Rashid M., Switzer C., Goderfroy S.B., Introduction of oats in the diet of individuals with celiac disease: A systematic review, In: Advances in Food and Nutrition Research, Steve L. Taylor, 2009, 235-285.
20. Shan L., Molberg O., Parrot I. et al., Structural basis       for gluten intolerance in       celiac sprue. Science, 2002, t. 297, 2275-2279.
21. Sollid L.M., Khosla C., Future therapeutic options       for celiac disease.       Nature Clinical Practice. Gastroenterology and Hepatology, 2005, t. 2, 140-147.
22. Thompson, T., Mendez Z., Commercial assays to assess gluten content of gluten-free foods: why they are not created equal. Journal of the American Dietetic Association, 2008, t. 108, 1682-1687.